注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
孔雀石綠PKM2 (D78A4) XP® Rabbit mAbL-賴氨酸

燦爛綠,亮綠Phospho-Drosophila Akt (Ser505) Antibody6-甲氧基-2,3,4,5-四氫吡啶

甲基綠THEX1 (D66A11) Rabbit mAb2,二-5-甲基吡啶

茜素綠;酸性綠25Phospho-Akt (Thr308) (244F9) Rabbit mAb(R)-縮水甘油

萘酚綠BPhospho-Akt (Thr308) (244F9) Rabbit mAb氧甲酰基亞基三基膦

固綠FCFPhospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAb甲酸

子種綠A；藍(lán)APhospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAb2-甲氧基基酸

亮綠SF(淡黃)Phospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAb甲氧基酸

健那綠BAkt3 Antibody2,3,4,6-四酰氧基-alpha-D-吡喃葡萄糖溴化物

酸性綠3CNOT3 (D4K4N) Rabbit mAb1-叔丁氧羰基哌

酸性綠 50 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb-2-吡啶甲酸

酸性綠APhospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb2-溴蒽醌

吲哚菁綠Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAbN-BOC-GAMMA-氨基丁酸

靛藍(lán)N-Cadherin Antibody9-溴菲

甲基藍(lán)CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb戊鈉

伊文思藍(lán)；埃文斯藍(lán)MST3b Antibody2-氨基--6-甲氧基嘧啶

曲利藍(lán)LSD1 (1B2E5) Mouse mAb5--2-氟

維多利亞藍(lán)B,性藍(lán) 26CXXC1 (D1R5R) Rabbit mAb2-溴-5-氟

N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR2 ELISA試劑盒TRBF1/TRF1  端粒體復(fù)制結(jié)合因子1100 ul

N端前腦鈉素(NT-proBNP)ELISA試劑盒TREM1  髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1100 ul

NOGO-A ELISA試劑盒TREM2  髓系細(xì)胞觸發(fā)受體220 ul

Na-K-ATP酶ELISA試劑盒TREML1/TLT1  髓系細(xì)胞觸發(fā)受體樣轉(zhuǎn)錄因子1100 ul

NAD(P)H脫氫酶(醌)1(NQO1)ELISA試劑盒TREML2/TLT2  髓系細(xì)胞觸發(fā)受體樣轉(zhuǎn)錄因子2100 ul

M型肌酸激酶(CKM)ELISA試劑盒Transferrin  轉(zhuǎn)鐵蛋白100 ul

L選擇素(L-Selectin/CD62L)ELISA試劑盒TRF2  端粒結(jié)合蛋白2100 ul

L-酸脫氫酶(L-LDH) ELISA試劑盒omerase Binding Proin, P23  端粒酶結(jié)合蛋白P23100 ul

KiSS-1受體(KISS1R)ELISA試劑盒TRIM32  TRIM3220 ul
豬肺炎支原體(MHP)核酸試劑盒價格纖維母細(xì)胞生長因子受體底物3抗體7-Acetoxy-4-methylcoumarin中文名：7-乙酰氧基-4-甲基別名：分子式：C12H10O4

纖維連接蛋白抗體Adresterone中文名：腎上腺甾酮別名：分子式：C19H24O3

凝血因子8/第八凝血因子/第八因子相關(guān)抗原抗體1-Acetylpiperazine中文名：1-乙酰別名：分子式：C6H12N2O

凝血因子11重鏈抗體(1S,2R)-2-Ami-1,2-diphenylethal中文名：(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇別名：分子式：C14H15

凝血因子12輕鏈抗體2-Acetylbutyrolactone中文名：2-乙酰基丁內(nèi)酯別名：分子式：C6H8O3
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。